OrchAId Protocols

🇬🇧 English (GB)

Tetrazolium Chloride Testing and Imaging Protocol

The current version of this document aims to outline a replicable system to photograph stained orchid seeds, in order to curate an image database for model training purposes. However, it leaves some room to use this opportunity to update your viability records using your own scoring protocol.

1% Tetrazolium chloride (TZ) solution preparation

Requirements:

• Potassium dihydrogen orthophosphate (KH₂PO₄) | SDS | CAS: 7778-77-0

• Disodium hydrogen orthophosphate dihydrate (Na₂HPO₄) | SDS | CAS: 10028-24-7

• 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride | SDS

• Precision balance

• Fume hood

• EN374 compliant gloves & EN166 compliant eye protection

• 1L amber bottle or 1L clear glass bottle and tin foil

• Distilled water

• Magnetic stirrer

• pH meter

Figure 1: 1L amber bottle containing 1% Tetrazolium

Procedure:

1. Dissolve 3.63 g of Potassium dihydrogen orthophosphate (KH₂PO₄) in 400 mL of distilled water in a glass beaker.

2. Dissolve 7.13 g of Disodium hydrogen orthophosphate dihydrate (Na₂HPO₄) in 600 mL of distilled water in a separate glass beaker.

3. When these stocks have completely dissolved, mix the two solutions in a 1 L glass container and add 10 g of 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride. Stir until all powder is dissolved and check that the pH of the solution is between 6 and 8.

4. Label the bottle with your initials, contents, creation date and the appropriate chemical hazard symbol (or following your specific lab protocols) then store in the dark at 4 °C for not longer than 3 months. If you have used a clear glass bottle rather than an amber glass bottle, wrap the bottle in tin foil before storing.

Note

Any reagent that develops a pink colour should be discarded

Orchid staining

Requirements:

• 5 cm diameter filter papers

• Aluminium foil

• Plastic covered paper clip

• Pencil

• 1% TZ solution (see previous section)

• Schott glass container 10-5 mL capacity

• EN374 compliant gloves

• Distilled water

• Safety goggles (EN166)

• Incubator at 30 °C

Procedure:

1. Fold a piece of filter paper to create a square packet following the diagram in Figure 2 (Steps 1 to 3)

2. Label the outside of the packet using a pencil with the seed accession or collection number (and the replicate number if appropriate).

3. Unfold the packet and place less than 300 orchid seeds from a single collection in the centre of the packet (Figure 2, Step 4). The correct number of seeds can be determined using seed weight data and a precision balance when available, or estimated by scooping seeds with a spatula, as shown in Figure 3.

4. Re-fold the packet into a square and use a plastic covered paperclip to seal the packet closed. (Figure 2 Steps 5-7)

5. Submerge the packet in 1% TZ solution in a Schott bottle wrapped in a double layer of aluminium foil (Figure 2, Step 8), ensuring the packet is fully submerged.

6. Place in an incubator at 30 °C for a minimum of 24 hours, but up to 48 hours.

Figure 2: Instructions to fold the paper correctly to ensure that seeds are not lost while submerged in TZ

Figure 3: A spatula containing an adequate volume of seeds for testing. This example uses a 100 mm-long spatula.

Microscope slide preparation for imaging

Requirements:

• Thin tweezers

• 1% TZ solution

• Glass microscope slide (frosted)

• Coverslip

• Pipette (1 mL)

• EN374 compliant gloves

• Safety goggles

Procedure:

1. Extract a packet from the TZ solution and carefully remove the paperclip without tearing the paper. Unfold the filter paper onto a flat surface.

2. With a pair of thin tipped flat ended tweezers, gently scrape the seeds from the filter paper onto a microscope slide. While some seeds will make it into the microscope slide, it is likely most seeds will stay attached to the tweezer tips due to static (Figure 4). These can be easily removed by carefully using a drop of 1% TZ from a standard 1 mL transfer pipette onto the tip of the tweezers over the microscope slide (Figure 5). The optimal number of drops of 1% TZ a microscope slide can hold is between 2.5 and 3 (2 drops if square).

3. Swirl the tweezers in the TZ solution on the microscope slide surface to ensure all seeds make it onto the slide and try to separate any seed clusters that might have formed (Figure 6).

4. Finally, carefully position the coverslip avoiding seeds and liquid from falling from the slide (Figure 7, this is where the 3-drop 1% TZ limit comes in handy) while minimizing the number of air bubbles present. To do so, try to press the middle of the cover glass on top of the liquid instead of starting to cover from the borders.

Figure 4: Seeds may stick to the tip of the tweezers after being scraped off the filter paper.

Figure 5: Use a drop of TZ to release seeds in the tweezer tips onto the microscope slide.

Figure 6: Distribute the seeds evenly in the drop of water by swirling the tweezers gently.

Figure 7: Place a coverslip on top of the microscope slide, minimizing the formation of bubbles as much as possible

Too many bubbles? Expand for some tips and tricks

Some bubbles may get trapped between the coverslip and the microscope slide, which could affect automated viability analysis. To minimize bubbles, position the 1 mL pipette near the gap between the coverslip and the slide, and slowly release some liquid to help dislodge the bubbles. This may cause some TZ solution to overflow onto the slide, but you can absorb the excess liquid with a towel.

Imaging set up and capture

Requirements:

• Dino-Lite model AM4113T

• Dino-Lite clamp e.g., RK-05

• USB backlit surface (light box) with adjustable brightness

• Laptop/Computer with a minimum of 2 USB ports

• DinoCapture software version 2 or 3 installed

Procedure:

1. Use the clamp to hold the dino-lite in a vertical position above the lightbox, ensuring it can be lowered until it almost touches the surface of the light box leaving enough space for a microscope slide to fit under it with a few millimetres to spare (see Figure 8, Figure 9 and Figure 10).

2. Turn on the computer and connect both the Dino-Lite and the backlit base via USB ports to the computer.

3. Turn on the light box following the instruction manual for your specific make and model.

4. Open the DinoCapture software (version 2 or 3) and:

• Turn off the Dino-Lite LED lights
• Turn off the auto exposure function (Figure 11).
• Select a shutter speed between 1/15 and 1/60 - Play with these two shutter speed options and the light box brightens to obtain homogeneous white background without overexposing seed edges (Fig. 12).

5. Move the microscope slide around under the lens to maximise the number of seeds within focus, adjusting the brightness and focus as needed.

6. Take a picture by pressing the camera icon in the software live view window (Figure 11)

7. To save the image, right click on top of the image thumbnail in the left panel and “save as”. Remove all ticks from the “Imprint” section and select maximum image size and dpi. Save the image in .jpeg format.

8. Ensure file name contains all important information about the collection (species name, collection or accession number, replicate number (if applicable) and create a backup to ensure the information is not lost.

Figure 8: Setup for imaging orchid viability

Figure 9: Dino-Lite positioned over microscope slide on back-illuminated base

Figure 10: Close-up showing separation between Dino-Lite and microscope slide

Figure 11: DinoCapture screenshot highlighting the LED switch and autoexposure button

Figure 12: Optimal image background colour shown in the middle image

References

Seed viability testing using the Tetrazolium Chloride stain (Draft) - Millennium Seed Bank, Standard Operating Procedures 2.2

Methodology for epiphytic orchid seed viability test using Triphenyl Tetrazolium Chloride (TZ) - Millennium Seed Bank, Standard Operating Procedures 2.21

Sigma’s 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride Safety Data Sheet | SDS

🇫🇷 Français (FR)

Test au chlorure de tétrazolium et protocole d’imagerie

La version actuelle de ce document vise à présenter un système reproductible permettant de photographier les semences d’orchidées colorées afin de constituer une base de données d’images à des fins de formation de modèles. Toutefois, cela laisse une certaine marge de manœuvre pour mettre à jour vos dossiers de viabilité à l’aide de votre propre protocole de notation.

Préparation de la solution de chlorure de tétrazolium (TZ) à 1%

Matériel requis:

• Dihydrogénophosphate de potassium (KH₂PO₄) | SDS | CAS: 7778-77-0

• Hydrogénophosphate de sodium dihydraté (Na₂HPO₄) | SDS | CAS: 10028-24-7

• Chlorure de 2,3,5-triphényl-2H-tétrazolium | SDS

• Balance de précision

• Hotte aspirante

• Gants conformes à la norme EN374 et lunettes de protection conformes à la norme EN166

• Flacon ambré de 1 litre ou flacon en verre transparent de 1 litre et feuille d’aluminium

• Eau distillée

• Agitateur magnétique

• pH-mètre

Figure 13: Flacon ambré de 1 litre contenant du tétrazolium à 1%

Procédure:

1. Dissolvez 3,63 g de dihydrogénophosphate de potassium (KH₂PO₄) dans 400 ml d’eau distillée dans un bécher en verre.

2. Dissolvez 7,13 g d’hydrogénophosphate de sodium dihydraté (Na₂HPO₄) dans 600 ml d’eau distillée dans un autre bécher en verre.

3. Lorsque ces stocks sont complètement dissous, mélangez les deux solutions dans un récipient en verre de 1 L et ajouter 10 g de chlorure de 2,3,5-triphényl-2H-tétrazolium. Agitez jusqu’à ce que toute la poudre soit dissoute et vérifiez que le pH de la solution est compris entre 6 et 8.

4. Inscrivez sur le flacon vos initiales, le contenu, la date de création et le symbole de danger chimique approprié (ou en suivant les protocoles spécifiques de votre laboratoire), puis stockez-le dans l’obscurité à 4 °C pendant une durée maximale de 3 mois. Si vous avez utilisé un flacon en verre transparent plutôt qu’un flacon en verre ambré, enveloppez le flacon dans une feuille d’aluminium avant de le conserver.

Note

Tout réactif qui prend une couleur rose doit être mis au rebut

Coloration des orchidées

Matériel requis :

• Papiers-filtres de 5 cm de diamètre

• Feuille d’aluminium

• Trombone recouvert de plastique

• Crayon

• Solution de TZ à 1 % (voir Section précédente)

• Flacon Schott d’une capacité de 10 à 15 ml

• Gants conformes à la norme EN374

• Eau distillée

• Lunettes de sécurité (EN166)

• Incubateur à 30 °C

Procédure :

1. Pliez un morceau de papier-filtre pour former un sachet carré en suivant le schéma de la Figure 14 (étapes 1 to 3)

2. Notez sur l’extérieur du sachet à l’aide d’un crayon le numéro d’accession ou de collection de la semence (et le numéro de réplicat, le cas échéant).

3. Dépliez le sachet et placez au centre de celui-ci moins de 300 semences d’orchidées provenant d’une seule collection (Figure 14, étape 4). Le nombre correct de semences peut être déterminé en utilisant les données relatives au poids des semences et une balance de précision lorsqu’elle est disponible, ou être estimé en ramassant les semences à l’aide d’une spatule, comme illustré à la Figure 15.

4. Repliez le sachet en carré et utilisez un trombone recouvert de plastique pour fermer le sachet. (Figure 14 étapes 5-7)

5. Immergez le sachet dans une solution de TZ à 1 % dans un flacon Schott enveloppé d’une double couche de feuille d’aluminium (Figure 14, étape 8), en veillant à ce que le sachet soit entièrement immergé.

6. Placez dans un incubateur à 30 °C pendant au moins 24 heures et optimalement jusqu’à 48 heures.

Figure 14: Consignes de pliage correct du papier afin de s’assurer de ne pas perdre les semences lorsqu’on les immerge dans le TZ.

Figure 15: Une spatule contenant un volume adéquat de semences pour le test. Cet exemple utilise une spatule de 100 mm de long.

Préparation des lames de microscope pour l’imagerie

Matériel requis :

• Pince à épiler fine

• Solution de TZ à 1 %

• Lame de microscope en verre (dépoli)

• Lamelle couvre-objet

• Pipette (1 ml)

• Gants conformes à la norme EN374

• Lunettes de sécurité

Procédure :

1. Extrayez un sachet de la solution de TZ et retirez délicatement le trombone sans déchirer le papier. Dépliez le papier-filtre sur une surface plane.

2. À l’aide d’une pince à épiler à bout plat et fine, grattez délicatement les semences du papier-filtre sur une lame de microscope. Bien que certaines semences peuvent se déposer sur la lame de microscope, il est probable que la plupart des semences restent attachées aux pointes de la pince à épiler en raison de l’électricité statique (Figure 16). Il est possible de les déposer en versant avec précaution une goutte de TZ à 1 % provenant d’une pipette de transfert standard de 1 ml sur la pointe de la pince à épiler au-dessus de la lame de microscope (Figure 17). Le nombre optimal de gouttes de TZ à 1 % qu’une lame de microscope peut contenir se situe entre 2,5 et 3 (2 gouttes si elle est carrée).

3. Faites tourner la pince à épiler dans la solution de TZ sur la surface de la lame de microscope pour faire en sorte que toutes les semences se retrouvent sur la lame et essayez de séparer les agglutinations de semences qui pourraient s’être formées (Figure 18).

4. Enfin, positionnez soigneusement la lamelle couvre-objet en évitant que les semences et le liquide ne tombent de la lame (Figure 19, justifiant la limite de 3 gouttes de TZ à 1 %) tout en minimisant le nombre de bulles d’air présentes. Pour ce faire, essayez de presser le milieu de lamelle couvre-objet sur le liquide au lieu de commencer à la positionner à partir des bords.

Figure 16: Les semences peuvent coller à l’extrémité de la pince à épiler après avoir été grattées sur le papier-filtre.

Figure 17: Utilisez une goutte de TZ pour déposer les semences se trouvant sur les pointes de la pince à épiler sur la lame de microscope.

Figure 18: Répartissez uniformément les semences dans la goutte d’eau en faisant tourner doucement la pince à épiler.

Figure 19: Placez une lamelle couvre-objet sur la lame de microscope en minimisant autant que possible la formation de bulles.

Trop de bulles ? Développez pour accéder à quelques conseils et astuces

Certaines bulles peuvent être piégées entre la lamelle couvre-objet et la lame de microscope, ce qui peut affecter l’analyse automatisée de la viabilité. Pour minimiser les bulles, placez la pipette de 1 ml près de l’espace entre la lamelle couvre-objet et la lame, et libérez lentement un peu de liquide pour permettre de déloger les bulles. Il se peut qu’une partie de la solution de TZ déborde sur la lame, mais vous pouvez absorber l’excès de liquide avec de l’essuie-tout.

Configuration de l’imagerie et capture des images

Matériel requis :

• Microscope Dino-Lite modèle AM4113T

• Statif de microscope Dino-Lite, par exemple RK-05

• Surface rétroéclairée USB (caisson lumineux) avec luminosité réglable

• Ordinateur portable / de bureau avec au moins 2 ports USB

• Logiciel DinoCapture version 2 ou 3 installé

Procédure :

Figure 20: Configuration pour l’imagerie de la viabilité des orchidées.

Figure 21: Dino-Lite positionné au-dessus d’une lame de microscope sur une base rétroéclairée.

Figure 22: Gros plan montrant la séparation entre le Dino-Lite et la lame de microscope.

1. Utilisez le statif pour maintenir le Dino-Lite en position verticale au-dessus du caisson lumineux, en veillant à ce qu’il puisse être abaissé jusqu’à presque toucher la surface du caisson lumineux et en laissant suffisamment d’espace pour qu’une lame de microscope puisse être placée en dessous avec quelques millimètres de réserve (voir Figure 20, Figure 21 and Figure 22).

2. Allumez l’ordinateur et connectez le Dino-Lite et la base rétroéclairée à l’ordinateur via les ports USB.

3. Allumez le caisson lumineux en suivant les instructions du manuel d’utilisation spécifique à la marque et au modèle.

4. Ouvrez le logiciel DinoCapture (version 2 ou 3) et :

• Éteignez les voyants lumineux du Dino-Lite
• Désactivez la fonction d’exposition automatique (Figure 23).
• Sélectionnez une vitesse d’obturation entre 1/15 et 1/60 - Jouez avec ces deux options de vitesse d’obturation afin que le caisson lumineux s’éclaircisse et pour obtenir un fond blanc homogène sans surexposer les bords des semences (Fig. 12).

5. Déplacez la lame du microscope sous l’objectif pour maximiser le nombre de semences mises au point, en ajustant la luminosité et la mise au point si nécessaire.

6. Prenez une photo en appuyant sur l’icône de la caméra dans la fenêtre de visualisation en direct du logiciel (Figure 23)

7. Pour enregistrer l’image, cliquez-droit avec la souris sur la vignette de l’image dans le panneau de gauche et sur l’option save as (« Enregistrer sous »). Enlevez toutes les coches de la section Imprint (« Impression ») et sélectionnez la taille maximale de l’image et le nombre de ppp. Enregistrez l’image au format .jpeg.

8. Veillez à ce que le nom du fichier contienne toutes les informations importantes concernant la collection (nom de l’espèce, numéro de collection ou d’accession, numéro de réplicat (le cas échéant)) et créez une sauvegarde pour vous assurer de ne pas perdre les informations.

Figure 23: Capture d’écran de DinoCapture mettant en évidence l’interrupteur à voyant lumineux et le bouton d’exposition automatique

Figure 24: La couleur optimale de l’arrière-plan de l’image est indiquée dans l’image du milieu.

Références

Seed viability testing using the Tetrazolium Chloride stain (Draft) - Millennium Seed Bank, Standard Operating Procedures 2.2

Methodology for epiphytic orchid seed viability test using Triphenyl Tetrazolium Chloride (TZ) - Millennium Seed Bank, Standard Operating Procedures 2.21

Sigma’s 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride Safety Data Sheet | SDS

🇵🇹 Português (PT)

Teste com Cloreto de Tetrazólio e Protocolo de Imagem

A presente versão deste documento tem como objetivo descrever um sistema reproduzível para fotografar sementes de orquídeas coradas, a fim de criar uma base de dados de imagens para fins de treino de modelos. No entanto, permite também aproveitar esta oportunidade para atualizar os registos de viabilidade utilizando o seu próprio protocolo de avaliação.

Preparação da solução a 1% de Cloreto de Tetrazólio (TZ)

Requisitos:

• Fosfato monopotássico (KH₂PO₄) | SDS | CAS: 7778-77-0

• Fosfato dissódico di-hidratado (Na₂HPO₄) | SDS | CAS: 10028-24-7

• Cloreto de 2,3,5-trifenil tetrazólio | SDS

• Balança de precisão

• Capela de exaustão

• Luvas em conformidade com EN374 e proteção ocular em conformidade com EN166

• Frasco âmbar de 1L ou frasco de vidro transparente de 1L com folha de alumínio

• Água destilada

• Agitador magnético

• Medidor de pH

Figure 25: Frasco âmbar de 1L contendo 1% de Tetrazólio

Procedimento:

1. Dissolver 3,63 g de fosfato monopotássico (KH₂PO₄) em 400 mL de água destilada num copo de vidro.

2. Dissolver 7,13 g de fosfato dissódico di-hidratado (Na₂HPO₄) em 600 mL de água destilada num copo de vidro separado.

3. Quando estas soluções estiverem completamente dissolvidas, misturar as duas num recipiente de vidro de 1 L e adicionar 10 g de cloreto de 2,3,5-trifenil tetrazólio. Mexer até todo o pó estar dissolvido e verificar se o pH da solução está entre 6 e 8.

4. Rotular o frasco com as suas iniciais, o conteúdo, a data de preparação e o símbolo de perigo químico apropriado (ou de acordo com os protocolos específicos do seu laboratório) e armazenar no escuro a 4 °C por um período máximo de 3 meses. Caso tenha utilizado um frasco de vidro transparente em vez de um frasco âmbar, envolver o frasco em folha de alumínio antes de armazenar.

Nota

Qualquer reagente que desenvolva uma coloração rosa deve ser eliminado.

Coloração das orquídeas

Requisitos:

• Papel de filtro com 5 cm de diâmetro

• Folha de alumínio

• Clipe de papel revestido de plástico

• Lápis

• Solução de TZ a 1% (ver secção anterior)

• Recipiente de vidro Schott com capacidade entre 10 e 15 mL

• Luvas em conformidade com EN374

• Água destilada

• Óculos de proteção (EN166)

• Estufa a 30 °C

Procedimento:

1. Dobrar uma folha de papel de filtro para criar um pequeno pacote quadrado, seguindo o diagrama da Figure 26 (Passos 1 a 3)

2. Identificar o exterior do pacote com um lápis, indicando o número de acesso ou de coleção da semente (e o número de réplica, se aplicável).

3. Desdobrar o pacote e colocar menos de 300 sementes de orquídea de uma única coleção no centro do papel (Figure 26, Passo 4). O número correto de sementes pode ser determinado utilizando dados de peso das sementes e uma balança de precisão, quando disponível, ou estimado retirando as sementes com uma espátula, conforme mostrado na Figure 27.

4. Voltar a dobrar o pacote em forma quadrada e utilizar um clipe de papel revestido de plástico para o fechar (Figure 26 Passos 5-7)

5. Submergir o pacote na solução de TZ a 1% dentro de um frasco Schott envolto em dupla camada de folha de alumínio (Figure 26, Passo 8), certificando-se de que o pacote fica totalmente submerso.

6. Colocar na estufa a 30 °C durante um mínimo de 24 horas, podendo permanecer até 48 horas.

Figure 26: Instruções para dobrar corretamente o papel de forma a garantir que as sementes não se perdem enquanto estão submersas na solução de TZ

Figure 27: Espátula contendo um volume adequado de sementes para o teste. Este exemplo utiliza uma espátula de 100 mm de comprimento.

Preparação da lâmina para microscopia e imagiologia

Requisitos:

• Pinças finas

• Solução de TZ a 1%

• Lâmina de microscópio de vidro (fosca)

• Lamelas

• Pipeta (1 mL)

• Luvas em conformidade com EN374

• Óculos de proteção

Procedimento:

1. Retirar o pacote da solução de TZ e remover cuidadosamente o clipe de papel, evitando rasgar o papel. Desdobrar o papel de filtro sobre uma superfície plana.

2. Com uma pinça de ponta fina e extremidade plana, raspar suavemente as sementes do papel de filtro para uma lâmina de microscópio. Embora algumas sementes caiam diretamente sobre a lâmina, é provável que a maioria fique presa às pontas das pinças devido à eletricidade estática (Figure 28). Estas podem ser facilmente removidas aplicando cuidadosamente uma gota de solução de TZ a 1% com uma pipeta de transferência padrão de 1 mL na ponta das pinças, sobre a lâmina (Figure 29). O número ideal de gotas de solução de TZ a 1% que uma lâmina de microscópio pode conter situa-se entre 2,5 e 3 (2 gotas, no caso de lâminas quadradas).

3. Mover as pinças em círculo sobre a superfície da lâmina, dentro da solução de TZ, para garantir que todas as sementes sejam transferidas para a lâmina e tentar separar quaisquer aglomerados de sementes que possam ter-se formado (Figure 30).

4. Por fim, posicionar cuidadosamente a lamela, evitando que as sementes e o líquido escorram da lâmina (Figure 31, é aqui que o limite de 3 gotas de solução de TZ a 1% se revela útil), minimizando o número de bolhas de ar. Para isso, pressionar o centro da lamela sobre o líquido em vez de começar a cobrir pelas bordas.

Figure 28: As sementes podem ficar presas na ponta das pinças depois de serem retiradas do papel de filtro.

Figure 29: Utilize uma gota de solução de TZ para soltar as sementes presas nas pontas da pinça sobre a lâmina do microscópio.

Figure 30: Distribua as sementes de forma uniforme na gota de líquido, movendo suavemente as pinças em círculos.

Figure 31: Coloque uma lamela sobre a lâmina do microscópio, minimizando ao máximo a formação de bolhas

Bolhas a mais? Expanda para ver algumas dicas e sugestões

Algumas bolhas podem ficar presas entre a lamela e a lâmina do microscópio, o que pode afetar a análise automática de viabilidade. Para reduzir o número de bolhas, posicione a pipeta de 1 mL junto à fenda entre a lamela e a lâmina, e liberte lentamente um pouco de líquido para ajudar a desalojar as bolhas. Isto pode fazer com que alguma solução de TZ transborde sobre a lâmina, mas o excesso pode ser absorvido com uma toalha.

Configuração e captação de imagens

Requisitos:

• Câmara Dino-Lite modelo AM4113T

• Suporte Dino-Lite, por exemplo RK-05

• Superfície retroiluminada USB (caixa de luz) com brilho ajustável

• Portátil/computador com um mínimo de 2 portas USB

• Software DinoCapture versão 2 ou 3 instalado

Procedimento:

1. Utilize o suporte para manter a câmara Dino-Lite numa posição vertical acima da caixa de luz, garantindo que possa ser baixada até quase tocar a superfície da caixa, deixando espaço suficiente para colocar uma lâmina de microscópio por baixo, com alguns milímetros de folga (ver Figure 32, Figure 33 e Figure 34).

2. Ligue o computador e conecte tanto a câmara Dino-Lite como a base retroiluminada às portas USB do computador.

3. Ligue a caixa de luz seguindo as instruções do manual do fabricante específico do seu modelo.

4. Abra o software DinoCapture (versão 2 ou 3) e:

• Desligue as luzes LED da Dino-Lite
• Desative a função de exposição automática (Figure 35).
• Selecione uma velocidade do obturador entre 1/15 e 1/60 – Experimente estas duas velocidades e ajuste o brilho da caixa de luz até obter um fundo branco homogéneo, sem sobre-expor as bordas das sementes (Fig. 12).

5. Mova a lâmina do microscópio sob a lente para maximizar o número de sementes em foco, ajustando o brilho e o foco conforme necessário.

6. Tire uma fotografia pressionando o ícone da câmara na janela de visualização ao vivo do software (Figure 35)

7. Para guardar a imagem, Clique com o botão direito do rato sobre a miniatura da imagem no painel esquerdo e selecione save as (guardar como). Remova todas as opções assinaladas na secção imprint (imprint) e selecione o tamanho e resolução máximos da imagem. Guarde o ficheiro no formato .jpeg.

8. Certifique-se de que o nome do ficheiro inclui todas as informações importantes sobre a coleção (nome da espécie, número de coleção ou de acesso, número de réplica, se aplicável) e crie uma cópia de segurança para garantir que as informações não se perdem.

Figure 32: Configuração para captura de imagens de viabilidade de orquídeas

Figure 33: Dino-Lite posicionada sobre a lâmina do microscópio em base retroiluminada

Figure 34: Close-up mostrando a distância entre a Dino-Lite e a lâmina do microscópio

Figure 35: Captura de ecrã do DinoCapture destacando o interruptor do LED e o botão de exposição automática

Figure 36: Cor de fundo ideal da imagem mostrada na imagem central

Referências

Seed viability testing using the Tetrazolium Chloride stain (Draft) - Millennium Seed Bank, Standard Operating Procedures 2.2

Methodology for epiphytic orchid seed viability test using Triphenyl Tetrazolium Chloride (TZ) - Millennium Seed Bank, Standard Operating Procedures 2.21

Sigma’s 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride Safety Data Sheet | SDS